摘要:通过研究Tn+人白血病Jurkat细胞中AChE的表达状况,可以分析Jurkat细胞AChE表达与Tn抗原表达水平的关系,从而为AChE用于肿瘤的预后判断或临床治疗提供实验依据。本论文利用ELISA、色度法试验在蛋白水平分析了AChE的表达状况,利用RT-PCR以及Real-timePCR试验在mRNA水平分析了AChE的表达状况结果显示:Jurkat细胞中AChE的含量及活性明显低于Tn-的白血病细胞K562,且二者又均低于正常白细胞由此认为,人白血病细胞中AChE的含量及活性低于正常细胞,AChE的表达与Tn-抗原的表达水平呈负相关,为肿瘤的临床判断提供了有力的依据.
关键词:AChE;Tn抗原;肿瘤;JurkatT
中图分类号:R730.3 文献标识码:A 文章编号:1007-7847(2015)01-0034-05
StudyontheExpressionProfileofAChEinLeukimiaCellLineJurkatTWhichisTnAntigenPositive
SUNXu-hong1,YUXiao-feng1,LINai-kun2,DUZhen-zhen1,LIXiao-yan1,HUTao1\”
(1.CollegeofBasicSciences,BinzhouMedicalUniversity,Yantai264003,Shandong,China;2.AffiliatedHospitalofBinzhou MedicalUniversity,Binzhou256603,Shandong,China)
Abstract:ToanalyzetherelationshipbetweentheexpressionofAChEandTnantigeninhumanleukimiacelllineJurkatTbystudyingtheexpressinglevelandactivityofacetylcholinesterase(AChE)inthesecells,whichwillprovideexperimentalevidencesaboutusingAChEtotreattumorandevaluateitsprognosis.The.studyanalyzedtheproteinactivityandcontentofAChEusingELISAandColorimetrictest,aswellasexam?inedthemRNAexpressionlevelbyRT-PCRandReal-timePCRassayinJurkatcells.TheresultsshowedthatthecontentandactivityofAChEinJurkatcells,whichwereTnantigenpositive,significantlylowerthanthatinhumanleukimiacelllineK562,whichwasTnantigennegative.Andbothofthemwerelowerthanthatinnormalwhitebloodcells.Therefore,theconclusionwasthatthecontentandactivityofAChEinhumanleukimiacellswerelowerthanthatinnormalwhitebloodcells.Therewasanegativecorrelationbe?tweentheexpressionlevelofAChEandTnantigen.Theresultswillprovidestrongsupporttodeterminetheclinicprognosisoftumor.
Keywords:AChE;Tnantigen;tumor;JurkatT
(LifeScienceResearch,2015,19(1):034~038)
乙酸胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)是中枢和外周胆碱能神经系统的重要组成成分,其经典的生物学功能是在神经突触间隙灭活神经递质乙酰胆碱(acetylcholine,ACh),达到终止神经冲动的目的。近年来的研究表明,AChE的表达并不局限于胆碱能神经系统,在许多非神经组织,诸入内皮细胞、上皮细胞、间皮细胞、免疫细胞、某些肿瘤细胞以及肿瘤组织,亦有不同程度的表达[1];并与细胞间的粘附、信号传递、细胞增殖分化以及细胞凋亡有关[2]。研究发现AChE可以通过灭活丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K/AKI),活化糖原合成激酶GSK3/3(glycogensynthesiskinase-3,GSK-3)等途径抑制肿瘤细胞的增殖[3],诱导细胞凋亡,AChE是一种新的凋亡调控因子[4]。在表达AChE的肿瘤组织中,AChE表达越高,病人预后越好;AChE甚至被认为可以单独作为肿瘤预后的重要标志[5]。抗原是一种常见的肿瘤相关抗原,其表达水平与肿瘤组织的TNM分期有关[6、7],与肿瘤的预后有关[8]。为彻底弄清Tn+肿瘤细胞中AChE表达状况,本文以JurkatT、K562及正常人白细胞(whitebloodcell,WBC)为研究对象,采用ELISA、色度法检测AChE的蛋白含量及水解活性;并提取RNA,通过RT-PCR、Real-timePCR克隆扩增AChEcDNA,进一步确定AChEmRNA的表达水平。分析探讨AChE与Tn抗原之间的关系,进一步明确AChE在Tn+细胞中的生物学作用。
1材料与方法
1.1细胞来源
Tn+细胞JurkatT与Tn-细胞K562由薛江楠博士惠赠,本室传代保存;正常人外周血WBC作为正常对照。 1.2主要试剂
人外周血白细胞分离液(Solarbio公司,中国);BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术公司);人乙酰胆碱酯酶ELISA试剂盒(K&D,北京奇松生物科技有限公司);anti-TnIgMMcAb为巨同忠博士惠赠(SantaCruz公司,美国);羊抗鼠lgM-FITC(SantaCruz公司,美国)。
1.3仪器设备
倒置显微镜IX-70(日本Olympus公司);生物安全柜(上海力康公司);冷冻离心机(ST16R,美国赛默飞世尔科技公司);漩涡混合器(VWR230,美国VWR公司);全波长酶标仪(TecanM1000,瑞士帝肯公司);Real-timePCR仪(Rotor-Gene-3000,澳大利亚Corbett公司);FACSCalibur流式细胞仪(BectonDickinson公司,美国)。
1.4Tn+、Tn-细胞培养和正常人白细胞分离
人类T淋巴瘤细胞系JurkatT和慢性髓原白血病细胞株K562于含10%FBS的RPMI1640(Hyclone)培养,37°C5%CO2培养72h,直接收集备用。正常人5mL肝素抗凝血,按人外周血门细胞分离液试剂说明分离白细胞,使用时用PBS悬起。
1.5超声提总蛋白
收集3种细胞悬液,离心、弃上清,重悬于2mL预冷的TBS缓冲液中,1200r/min,4℃离心10min;弃上清,冰浴上加入TBS缓冲液1mL、蛋白酶抑制剂10pL;超声时间2min,停1min,5个循环,700g,4℃离心10min;吸取上清于EP管内,加入0.5%TritonX-100,冰浴30min;按BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书测样品的总蛋白浓度。
1.6AChE活性测定
利用乙酰胆碱酯酶催化硫代底物出现显色反应来测定AChE活性。96孔板,每孔加入0.1tnol/LPBS50μL,超声提取的蛋白样品10μL、10mmol/LS-AchI30μL,充分混匀,放入37℃培养箱内孵育5min或15min;加入1mol/LHC110μL,震荡混匀,终止反应;10min后加0.03%DTNB200μL,总体积300μL,震荡混匀;5min后酶标仪上405nm波长处测0D值;15min后405nm测OD值,15minOD值减去5min0D值,求得□A;根据公式AChE(U/mL)=AA/minx0.3/(13.6×0.01×1),再除以相应蛋白浓度,求出AChE活性。
1.7ELISA测AChE蛋白表达量
应用双抗体夹心法,具体步骤按照ELISA试剂盒(R&D)说明书进行操作。
1.8总RNA提取
按照Trizol试剂盒(Invitrogen)提取细胞总RNA,-80℃保存备用。
1.9RT-PCR1.9.1引物设计
根据NCBI数据库检索AChE、GAPDH基因的cDNA序列,用PrimerExpress2.0软件设计,由上海硕世生物科技有限公司合成(表1)。
1.9.2cDNA合成与PCR反应
逆转录体系20m-L:TotalRNA1|j.g,Oligo(dt)Primer(2.5μmol/L)1μL,RNaseFreewater适量,定量至总体积13μL。65°C,10min,立即置于冰上,静置2min,加入5xRTBuffer4μL,dNTPMix-ture(各10mmol/L)2μL,RNaseInhibitor(40U/μL)0.5μL,ReverTraAce(20U/(μL)0.5μL。55℃孵育30min,85℃加热5min,-20℃保存备用。PCR反应体系20μL:qPCRMasterMix(2x)10μL,上、下游引物(10μmol/L)各1μL,cDNA模板1μL,DD Water7μL;PCR反应条件:95℃预变性3min;30x(95℃,30s;57°C,30s;72°C,30s),72℃延伸1min。PCR产物于2%琼脂糖凝胶电泳检测分析。
1.10 Real-timePCR
1.10.1引物设计
引物序列用PrimerExpress2.0软件设计,由上海硕世生物科技有限公司合成(表2)
1.10.2基因水平的定量检测
采用FAM荧光探针法,GAPDH作为内参,Real-timePCR反应体系20μL:qPCRMasterMix(2x)10μL,上、下游引物(10μmol/L)各1μL,荧光探针(10μmol/L)0.5μL,cDNA模板1-2μL,DDWater加至20μL,每一样品做3个复孔;Real-timePCR反应条件:40x(95℃,5min;95℃,10s,55°C,40s,72℃,1min)。
1.11 统计学处理
本文中的所有数据均应用SPSS统计软件作统计学处理,多组间两两比较采用Krnskal-WallisH检验,P< 0.05为差异有显著性。
2结果
2.1Tn抗原的表达状况
流式细胞仪检测结果显示,白血病细胞系JurkatT表达Tn抗原(图1A);白血病细胞K562与正常WBC不表达Tn抗原(图1B、C)。
2.2AChE在蛋白水平的表达分析
Tn+细胞(JurkatT)AChE活性与Tn-细胞(K562,正常对照WBC)相比,活性明显下降;Tn-细胞之间,即K562与正常WBC的AChE活性相比,K562明显低于正常WBC(n=5,P< 0.01,图2A)。ELISA试剂盒检测AChE表达水平,结果显示Tn+细胞(JurkatT)与Tn-细胞(K562,正常对照WBC)相比,AChE蛋白含量明显下降;K562与正常WBC相比,K562明显低于正常WBC(n=5,P< 0.01,图2B)。 2.3AChE在转录水平的表达分析
采用RT-PCR、Real-timePCR方法,以GAPDH为内参,比较JurkatT、K562和WBC目的基因的相对mRNA的表达水平(见图3A、B),结果显示:JurkatT细胞AChEmRNA水平明显低于K562和WBC;K562与正常WBC相比,K562AChEmRNA水平低于正常WBC。
3讨论
AChE是催化水解乙酰胆碱为胆碱和乙酸,恢复突触后膜极化的酶,在传递神经冲动的过程中起重要作用。近期研究发现AChE不仅局限于中枢和外周神经系统,在一些非神经组织和器官,如上皮组织、血细胞等中也有存在[9]。更值得注意的是,AChE的表达异常与多种肿瘤的发生、发展及预后有关。包括神经系统肿瘤例如星形胶质细胞瘤[10]和非神经系统的肿瘤,如乳腺癌[11]、肝癌[3]、结肠癌等。Tn抗原是肿瘤相关抗原,人类70%~80%的癌症组织,包括乳腺癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、皮肤癌均可检测到Tn抗原的表达,并且Tn抗原的表达与肿瘤的发生、发展、转移及预后密切相关[12]。
尽管已在多种类型的肿瘤细胞中发现了AChE的表达水平较正常细胞偏低[13、14],但是在Tn+的肿瘤细胞中AChE的表达水平如何未见报道我们分别从基因及蛋白水平研究AChE在正常白细胞及白血病细胞的表达状况。发现白血病细胞JurkatT及K562中AChE的活性及含量均低于正常白细胞,而JurkatT细胞中AChE的活性及含量明显低于K562细胞。更值得注意的是JurkatT细胞表达Tn抗原,但K562细胞不表达Tn抗原。
总之,我们首次提出在人白血病细胞中AChE的表达及活性与Tn抗原的表达成负相关。目前研究认为肿瘤细胞中Cosmc基因异常导致T-synthase折叠错误,糖基化途径异常致Tn抗原的表达AChE基因位于人类7号染色体上(7q22),白血病、卵巢癌和乳腺癌AChE7q22染色体缺失,骨髓增生异常综合征、急性髓样白血病AChE基因拷贝数量改变,肺癌组织中AChE糖基化异常。AChE经过连接糖基化、适当折叠盘曲才能形成有活性的AChE,缺乏糖基化修饰的AChE活性下降臣多在内质网降解;AChK3个糖基化位点上(AChETN296Q、AChh:TN381Q、AChETN495Q)任一位点的突变体及3个位点同时突变的突变体(A-ChETN296Q/N381Q/N495Q)转染目的细胞,AChE活性有不同程度的下降,AChETN381Q、AChE-TN296Q/N381Q/N495Q尤为明显[16、17]。因此AChE基因转录水平及转录后修饰的异常可能是影响AChE表达的主要原因:这与我们发现的膜糖蛋白糖基化异常导致肿瘤细胞表达Tn抗原,似乎存在某种关联与Tn-肿瘤细胞相比,Tn+的肿瘤细胞中AChE的基因是否有异常,Tn+的肿瘤细胞中AChE对肿瘤细胞的增殖及凋亡的影响如何还有待进一步研究。
4展望
我们研究发现在白血病细胞中,AChE的表达与Tn抗原的表达呈负相关。有研究表明,虽然在结肠癌细胞中AChE的表达量较正常细胞低,但在不表达Tn抗原的结肠癌细胞系Caco-2中AChE过表达。提示可能在结肠癌细胞中Tn抗原的表达与AChE的表达也存在负性相关的关系:有关Tn抗原及AChE在肿瘤细胞中异常表达的机制研究均有相关报道。但在Tn+的肿瘤细胞中,AChE表达量及活性降低的机制尚不清楚,可能Tn抗原的表达影响了AChE的代谢和信号转导的相关蛋白。在其他Tn+的肿瘤细胞及组织中是否也存在AChE的表达异常仍待深人研究明确Tn抗原与AChE在肿瘤细胞中表达之间的关系,有助于全面了解AChE及Tn抗原的生物学功能,认清Tn抗原及AChE异常表达的病理学意义,为肿瘤的诊断、治疗及预后提供新的实验依据,为以Tn抗原或AChE为靶点治疗肿瘤制定新策略。
[1]ZHANG X J. GREENBERG D S.Acetylcholinesterase involvement in apoptosis [J]. Frontiers i 5(40):1-6.
[2] JOHNSON G, MOORE S W. Identification of a structural site on acetylcholinesterase that promotes neurite outgrowth and binds laminin-1 and collagen IV[J]. Biochemical and Biophys?ical Research Communications, 2004, 319(2) :448-455.
[3] ZHAO Y J, WANG X Y, WANG T, et al. Acetylcholinesterase, a key prognostic predictor for hepatocellular carcinoma, sup?presses cell growth and induces chemosensitization[J]. Hepatol- ogy, 2011, 53(2):493-503.
[4]GARCIA Z, KUMAR A, MARQUES M, et al. Phosphoinositide 3―kinase controls early and late events in mammalian cell di?vision! J|. EMBO Journal, 2006, 25(4): 655-661.
[5] QAV1 H. AL-RAJHI A A. Acetylcholinesterase and HHV-8 in squamous cell carcinoma and retinoblastoma[J]. In Vivo, 2009, 23(5): 679-683. [6]胡涛,刘希伟,董孟华.非编码区基因突变对Tn+肿瘤细胞 Cosmc mRNA的影响[J].中华微生物学和免疫学杂志(HU Tao, LIU Xi -wei. Dong Meng-hua. Effects of mutation in Cosmc non-coding region on the transcription level of Cosmc mRNA in Tn antigen positive tumor cells[JQ. Chinese Journal of Microbi?ology and Immunology), 2011, 31(4) : 294-298.
[7]胡涛,刘希伟,付强,等.T-Synthase活性对胃癌Tn/STn及T/ST抗原表达的影响[J].中华微生物学和免疫学杂志(HU Tao, LIU Xi-wei, FU Qiang, et al. Effects of T-Synthase activity on the expressing of Tn/STn and T/ST antigen in gastric carcino?ma tissues[J]. Chinese Journal of Microbiology and Immunolo?gy), 2009, 29(8):762-766.
[8]FERNANDEZ M F, TANG N, ALANSARI H, et al. Improved approach to identify cancer-associated autoantigens[J]. Autoim?munity Reviews, 2005, 4(4):230-235.
[9]HORIUCHI Y, KIMURA R, KATO N, et al. Evolutional study on acetylcholine expression[J]. Life Sciences, 2003, 72(15):1745 -1756.
[10]BARBOSA M,RIOSO,VELASQUEZ M, et al. Acetyl cholinesterase and butyrylcholinesterase histochemical activities and tumor cell growth in several brain tumors[J|. Surgical Neurology, 2001, 55(2):106-112.
[11]FRANCISCORE,JUANCH,JULIAN I,etal.Breast cancer metastasis alters acetylcholinesterase activity and the composi?tion of enzyme forms in axillary lymph nodes[J]. Breast Cancer Research and Treatment, 2003, 80(1):105-114.
[12]JU T Z, OTTO V I,CUMMING R D. The Tn antigen-struc- tural simplicity and biological complexity[J]. Angewandte Chemie (International ed. in English), 2011, 50(8):1770-1791.
[13]MONTENEGRO M F, RUIN-ESPEJO F, CAMPOY F J, et al. Cholinesterases are down-expressed in human colorectal carci-noma[J]. Cellular and Molecular Life Sciences, 2006, 63(18):2175-2182.
[14]VIDAL C J. Expression of cholinesterases in brain and non- brain tumours[J]. Chemico-Biological Interactions, 2005, 157- 158(0):227-232.
[15]JU T Z, CUMMINGS R D. A unique molecular chaperone Cosmc required for activity of the mammalian core 1 beta 3- galactosyltransferase[J].Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America, 2002, 99 (26):16613-16618.
[16]HU T, FU Q, LIU X W, et al. Increased acetylcholinesterase and capase-3 expression in the brain and peripheral immune system of focal cerebral ischemic rats[J].Journal of Neuroimmunology, 2009, 211(1-2):84-91.
[17]李春辉,何群,马静红,等.应用凝集素芯片分析癌细胞膜 表面糖链表达[J].生命科学研究(LI Chun-hui, HE Qun, MA Jing -hong, et al. Analysis of glycan profiling on the cancer cell surface by lectin microarray[J]. Life Science Research), 2010. 14(2):130-136.
发表评论